用电化学技术和扫描电镜评估防腐涂层的真菌腐败
作者 Sol Roselli，工程学院；Cecilia Deyá，工程学院，CONICET Researcher公司；Natalia Bellotti，自然科学与博物馆学院，CONICET Researcher公司，国立拉普拉塔大学，阿根廷，拉普拉塔
微生物会在潮湿条件下，在各种材料上生长，包括金属、无机矿物和有机聚合物等。一个复杂的微生物群落及其胞外多糖建立的生物膜是腐蚀和/或底层材料恶化的先决条件。这影响了诸如桥梁和管道等具有巨大经济价值的金属结构；输气管道中70%的腐蚀是由微生物引起的。金属结构通常采用防腐蚀涂层保护，但这些涂层上的生物膜会导致起泡和附着力损失，从而导致防护体系失效。
丝状真菌被认为是造成漆膜腐蚀最严重的微生物。 它们是真核微生物，具有广泛的营养相网络（菌丝体），可释放酶、糖蛋白和有机螯合剂。 8 因此，它们积极参与腐蚀过程，因为它们可以通过化学降解、差异曝气和破裂区来改变它们生长的基质。 4,9 从这个意义上说，局部腐蚀已被证明与真菌菌丝具有空间关系。 10 真菌生长在一个很宽的pH范围内，是最耐干燥的微生物，在对细菌来说湿度太低的情况下仍能保持活性，并且还形成了耐干燥剂的孢子。 11,12 真菌影响腐蚀(FIC)是一种电化学过程，在这种过程中，真菌的参与能够引发、促进或加速腐蚀反应。 4 因此，基材的金属防护需要更全面地考虑使用特殊涂层来防止腐蚀，考虑到防护体系对真菌的敏感性，以防止将来会出现的漆膜损坏。
本研究利用电化学技术（腐蚀电位和离子电阻）对不同防腐涂层的真菌腐败进行了评估。首先，采用传统微生物技术从生物降解的漆膜中分离出真菌，然很选择并鉴定了与研究对象相关的最常见和最易产生腐败的真菌，鉴定是基于微观和宏观形态的观察。对分离到的菌株进行了分子分析，
以支持其鉴定。
我们选择曲霉属（H1）和青霉属（H2）真菌接种被评估的漆膜，并研究了含不同类型防锈颜料（磷酸锌和稀土改性沸石）的涂料和不含防锈颜料的涂料。应该考虑的是，在过去，用铬酸锌配制的涂料可以防止微生物生长，且具有相当大的抗腐蚀能力。 6 但由于铬酸盐的高毒性，使其后来被禁用，新型防腐颜料也得到了广泛研究。使用铈或镧等稀土金属（REM）阳离子改性的填料颜料可替代磷酸盐，因为发现它们具有优异的抑制性能，可被视为“绿色”抑制剂。
将接种的样品和相应的参考样品置于容器中，调节内部相对湿度。 19 两个月后，对接种的试验基质进行电化学测量。结果表明，电化学技术有助于鉴别不同种类的真菌对防腐涂料的降解活性。
材料和方法
真菌的分离、鉴定及分子分析
我们从拉普拉塔市（34°54’S和57°55’W）采集生物降解的涂层样板，抽吸后再用生理溶液（PS）稀释。用孟加拉玫瑰红培养基（BR）（2.0 g琼脂、2.5 mg孟加拉玫瑰红、1.0g葡萄糖、0.5 g蛋白胨蛋白酶、0.1 g磷酸二氢钾、0.05 g硫酸镁和蒸馏水至100 mL）将100 mL的稀释液接种在培养皿上。此外，为了防止细菌生长，在培养基中加入了抗生素。BR限制菌落扩散而不影响孢子萌发。培养皿在28°C下培养至少72小时，以通过常规微生物技术继续进行真菌的分离。
根据真菌的微观和宏观形态特征，采用标准分类学检索表对其进行鉴定。 13、14 为改进菌株，对其进行了微培养观察和棉蓝染色，筛选出最常见、最易变质的真菌。
所选真菌通过PCR（Macrogen Korea）扩增的真菌ITS区直接测序，进行分子分析以确认鉴定。 20 所用引物为ITS1（5?-TCC GAT GGT GAA CCT GCG G-3?）和ITS4（5?-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3?）。使用GenBank数据库 21 ，通过Blast搜索对序列进行分析，以找出已知的最接近的相似序列。
为了评估真菌的降解活性，将分离出的真菌在与之前相同的培养基BR上生长，但不添加孟加拉玫瑰红，加入0.1%w/v的碳酸钙，并在28°C下培养7天。菌丝体周围形成的晕圈证明被试真菌释放了酸。
涂料的配制和制备
防腐颜料的选择
我们选择了三种不同的防腐蚀颜料。一种是传统的磷酸锌，另一种是取代磷酸锌的稀土离子交换型沸石。由于磷酸盐会导致水体富营养化，而锌本身又具有毒性，磷酸锌已经引起了一些环境问题，因此人们正在寻找替代品。另一方面，铈和镧交换沸石作为无机绿色抑制剂正在被研究，沸石是一种天然矿物，镧系离子的毒性比钠小。这些颜料的获得方法在别处有详细说明。
涂料的配制、制备和应用
表1显示了涂料的组成成分。在所有情况下，防腐蚀颜料的含量占颜料混合物总体积的30%，该值通常为磷酸盐颜料的推荐值。 22-24 配方所使用的防腐蚀颜料为：磷酸锌（PZ20，SNCZ）、Ce（III）离子改性沸石（ZCe）和La（III）离子改性沸石（ZLa）。两种交换型沸石均在实验室制备。 17 同时制备了不含腐蚀颜料的涂料。用硫酸钡、二氧化钛和滑石粉配制了颜料。以矿物油为溶剂，添加溶剂型醇酸树脂（Alkypol 434/50）使PVC/CPVC比值（颜料体积浓度/临界颜料体积浓度）保持在0.7。使用不同的添加剂：润湿分散剂（TEGO 652，1%v/v）、基材润湿剂（TEGO 270，1%v/v）、流平剂（TEGO 270，1%v/v）、钴-（Casaldel Rey，0.06%v/v）和钙基催干剂（Casal del Rey，0.12%v/v）。
在所有情况下，涂料都是在球磨机中制备的， 25,26,17 使颜料在载体（溶剂和树脂）中分散24小时，直至达到可接受的细度（赫格曼细度5级）。
对SAE 1010（15.0 x 7.5 x 0.2 cm）钢板进行喷砂处理，达到Sa 2 ½级（SIS 05 59 00标准），用甲苯脱脂，并涂上配制的涂料。干膜厚度为80±10μm，在试验前，在实验室环境（20±2°C和65%相对湿度）中将涂漆面板静置7天。
用电化学方法评估真菌的生物降解
随后采用了与E.Juzeliunas等人2007年使用的方法相似的方法。 19 首先，将所选真菌的培养物置于BR培养基中，28°C培养15天，制备其悬浮液。用Neubauer计数池调节分生孢子浓度至105/mL。所用悬浮液成分为：每1000 mL蒸馏水5.0g NaCl、1.0 g HK 2 PO 4 、1.0 g（NH 4 ）H 2 PO 4 、1.0 g（NH 4 ）2 SO 4 、0.2 g MgSO 4 、3.0 g KNO 3 、0.05 g Tween20。
在每个培养皿上建立三个培养细胞，用丙烯酸管（7.0cm高）在漆膜表面上划定3cm 2 圆形区域。用紫外线杀菌灯（飞利浦，20W）在每侧照射这些细胞40分钟，并接种100μL真菌悬浮液。同时配制无真菌孢子的无菌溶液100μL作为参考样品。将样品置于5L容量的环境测试箱（EC）中，用1L饱和硫酸钾溶液将相对湿度保持在97%。然后，在进行相应的电化学测量之前，将测试箱关闭，并在25±2°C的实验室条件下放置2个月。使用三个测试箱用来防止污染，一个装有参考样品，另一个装有每种选定的真菌。时间是根据目录数据规定的，并考虑到对所用方法的初步评价。
通过测量漆膜的离子电阻和基材的腐蚀电位，来评估真菌的腐败。选择这些变量时，考虑到了涂层提供的金属保护是由阻隔效应和由于活性颜料的存在而产生的防腐作用来提供的。 27-29 离子电阻的测量是研究阻隔效应的一个很好的工具，由于孔隙的存在、涂层渗透性的增加，阻隔效应会随着水的进入而减弱。阻隔效应通常会延缓水的进入，但一旦水到达金属表面，防腐颜料将起着主要的防护作用。
使用频率为1000 Hz的ATI Orion 170型导线测量涂漆钢基板和铂电极之间的电阻。用高输入阻抗电压表和饱和甘汞电极（SCE）监测腐蚀电位。测量之前，在丙烯酸管中加入10毫升聚苯乙烯作为电解质。
测量后，用移液管从靠近漆膜的上清液中提取样品，并用BR（不含孟加拉玫瑰色）进行电镀，以验证参考样品中微生物生长的缺乏，而在试验开始时接种的其他样本的真菌生长。
扫描电镜 (SEM) 观察
用扫描电镜（SEM）观察了在EC中暴露2个月的样品。操作条件为低真空（10 -2 -1 Torr），显微镜为Philips FEIQuanta 200。观察条件建立在这类样品不需要脱水来保持其自然形态的基础上。
用镊子从面板上取下油漆，并用扫描电镜观察下面的金属。
结果与讨论
真菌的分子分析与鉴定
我们选择了最常见和最易变质的真菌，并对其进行了筛选和分子分析。图1a和c显示了所选菌株在BR中的培养1周的情况。图1b和d显示了通过光学显微镜对微培养物的一些观察结果。在这些图像中，可以看到与曲霉属和青霉属 13,14 相对应的特有形态的分生孢子。两种情况下均观察到球形分生孢子。从曲霉菌属中分离到的菌株最为常见，而青霉由于释放大量酸性化合物而更为腐败，这在添加0.1%w/v CaCO 3 的BR中生长时得到证实。在培养周结束时，由于释放的酸与CaCO 3 的反应，在菌丝体周围形成了一个晕环，如图1e所示。这使人们想到它对金属的腐蚀性。
通过对NCBI数据库中可用序列的Blast搜索，分析了用于进行生物测定的分离菌株核糖体DNA序列的ITS区域。基于GenBank数据库中ITS序列的最接近匹配，真菌鉴定结果为烟曲霉和青霉群落，访问号分别为AB976023.1和HQ652873.1，与已知物种的相似性分别为97%和98%（E=0）。形态学分析支持NCBI序列数据的鉴定。获得的序列已保存在GenBank数据库中，并分别对分离得到的真菌A.fumigatus和P.commune进行了KU936230和KU936231访问号分配。
电化学方法评估真菌的生物降解
在试样的潜伏期结束后，进行相应的电化学测量。图2a和b分别显示了离子电阻（Ri）和腐蚀电位（Ec）的测量值。可以观察到，所有涂料的离子电阻和腐蚀电位值都遵循相同的趋势。参考样的Ri值在106和107Ω.cm 2 之间，而与烟曲霉接触的涂料的Ri值比参考样低一个数量级以上（103和105Ω.cm 2 ），而与P.commune接触的涂料的Ri值甚至更低（103和104Ω.cm 2 ）。所有涂漆板的腐蚀电位值，一般来说，接种板的腐蚀电位值比参考板的腐蚀电位值更低。
不同的防腐蚀颜料所能提供的保护作用不同，从而导致参考样的Ri和E值存在差异。 17,30 这些结果表明，本研究中使用的真菌的存在通过降低其阻隔能力（由于菌丝的渗透而在涂料中产生孔隙和打开通道，促进水的进入或增加渗透性），加速了腐蚀过程的开始，改变了漆膜，因为水很容易渗入涂层，更快地到达金属基材。此外，真菌释放的酸也会增强腐蚀。
从每个样品中提取PS，在28°C下培养48小时，接种的涂料在所有板上均呈阳性结果（观察到生长），而参考涂料（未接种）在预先设定的条件下暴露2个月后呈阴性（无生长）。这些结果与离子强度和腐蚀电位的测量结果一致，即在未观察到真菌生长的面板上（参考样），记录了更高的电阻值和更高的正腐蚀电位。与P.Commune接触的面板上显示具有最低的Ri测量值和最负的Ec值，这表明这种真菌对所研究涂料的腐蚀作用更大。这一结果与用碳酸钙得到的结果一致，表明其具有更大的腐败活性。
扫描电镜(SEM) 观察
图3、4、5和6显示了2个月后未接种的（a）涂漆面板（分别使用涂料1、2、3和4）和相同配方接种了P.Commune的另一个面板（b）的SEM显微照片。此外，还可以观察到接种脱漆后暴露的金属基材的显微照片。
在未接种的基材上，正如预期的那样，在所有情况下都未观察到真菌生长。所有接种的涂料都呈现出某种程度的真菌生长，与其他涂料相比，涂料2和涂料3（图4和图5）的真菌生长程度较低。在参考漆上观察到的生物膜（图3b）最多，尤其是在涂料4上，这显示出真菌的生长程度高，有大量的专门繁殖菌丝和分生孢子散布（图6b）。与其他涂料相比，这种涂料表现出更大的腐蚀程度。我们可以看到接种的真菌侵入性生长，穿过漆膜，直到到达金属基材，在那里可以看到大量的菌丝和分生孢子（图6c）。这些显微镜观察结果与测得的离子电阻值一致，是所有测试涂料中最低的。
结论
利用分子生物学方法可以从拉普拉塔市的涂层样品中分离和鉴定出常见和最易产生腐败的真菌样本，即烟曲霉（KU936230）和P.commune（KU936231）。
电化学测试表明，除含30%铈离子交换型沸石的涂料外，烟曲霉和P.commune使涂层离子的电阻降低，腐蚀电位趋于负值。
在接种的涂料面板上可以观察到真菌生长（宏观和微观），这些结果与电化学测量的记录值保持一致。
利用电化学技术可以评估真菌生物膜在涂漆钢基材上引起的生物腐败。
宜考虑在防腐蚀涂料配方中添加杀菌剂。
了解更多详细信息，请发送电子邮件至c.deya@cidepint.ing.un-lp.edu.ar。
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本文收录在《PCI中文版》杂志2021年2/3月刊中
